RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. Exon skipping.. 핵안을 공략하라..

얼마전 남녀간의 소통방식 차이에 대한 “신도림역 영숙이” 동영상이 주목을 받은 적이 있었다.

 

아마 이런 차이는 “academic researcher”와 “industry researcher”간에도 존재하는 것 같다.

그냥 새로운 사실 자체에 즐거워하고 신기해하고, 놀라와 하는 연구자들이 있지만 – 최소한 논문을 낼 수 있으면 -산업계 연구자들은 개념없는 남자들의 소통방식처럼 물는다. “So what?” “그래서?”

RNA splicing 조금 더 나가서는 alternative splicing 그 자체에 놀라 하면서 “신도림역 영숙이”를 본 사실 자체에 놀라와서 하듯 이야기 하는 사이…  일부 학자들은…이런 현상을 이용해서 신약으로 뭔가 해볼 수 있겠다는 생각을 했는데 그게 바로  Exon skipping(혹은 cassette exon이라고도 함)이다.

우선 이미 이야기했던 Dystrophin이라는 단백질에 해당하는 유전자인 DMD를 이야기해야 한다.

이미 말했듯이 실제 coding 하는 단백질은 3,685 aa밖에 안되는데, 크로모좀 상에서 유전자의 크기는 무려 2.5M nt…. 인간유전체의 거의 1%를 차지한다.  결국 99%이상의 primary transcript는 intron…. 총 엑손의 숫자는 79개….

전체 primary transcript의 길이를 30 m 라고 하면 mature mRNA는 30cm 자 정도 길이…

이 유전자는 X chromosome에 있고 위치는  테21.2-1이다. 워낙 커서 21.2.X이 아니고 그냥 21.2이다.

알다시피 X크로모좀은 남자들에게만 있으니, 여기에 문제가 생기면 남자에게만 나오는 질환인데….

디스트로핀이라는 단백질은 근육세포 내의 액틴 구조체와 세포막간을 중간중간 연결해 주는 역할을 하는 단백질로 전체 근육 단백질의 0.002%만 차지하는 아주 마이너한 단백질이다.

Dystrophin complex

그런데 약 6천명 중 한명꼴로 남자 소아에서 dystrophin의 기능이 부분적인 경우 혹은 기능이 완전히 없는 경우들이 나온다.

이런 경우를 muscular dystrophy (근육이영양증)이라고 하고 부분적으로나마 dystrophin의 기능이 있는 경우를 발견자의 이름을 따서 Becker’s Muscular Distrophy라고 하고 dystrophin의 기능이 완전히 없는 경우를  발명자의 이름을 따서 Duchenne (뒤센, 혹은 뒤세인이라고 읽는다) Muscular Dystrophy -뒤센형 근육이영양증-이라고 한다. BMD는 그래도 임상적으로 증상이 DMD에 비해 심하지 않은 편이라고 한다.

위와 같은 BMD난 DMD의 원인을 보니 이러했다.

어떤 이유에서인지 약 70%의 환자들이 최소한 하나 이상의 엑손이 삭제되면서 reading frame이 밀려서 정상적인 translation이 안되고 중간에 premature stop codon (혹은 premature termination codon, 정상적인 경우는 단백질을 코딩하는 지역이 끝나는 지점에 termination codon이 있어야 하는데, reading frame이 밀리면서 중간에 생기는 stop codon이 생기는 경우) 이 생기면서 단백질 합성이 중간에 멈춰버리는 것이다.

 

Screenshot 2014-08-14 at 09.24.29 오후

위의 예의 경우는 exon 49번과 50번이 누락되면서 exon48과 exon51이 결합하는데 이 경우 reading frame이 밀리면서 중간에 premature stop codon이 생기면서 단백질 합성이 중간에 멈추는 경우이다. 이렇게 만들어진 단백질은 dystrophin으로서의 기능을 전혀 못하는 단백질이다. 이 경우가 DMD에서 가장 흔한 경우이다.

이걸 멍하니 보고 있다가, 누군가가(?) 생각해 냈다.

 “open reading frame을 회복하려면 48번이 52번하고 연결되면 되는데……. “

그리고 흔히 말하는 앤티센스(antisense)를 이용해서 51번 엑손이 정상적으로 splicing이 되지 않도록 올리고머를 만들어서 pre-messenger RNA 상에서 올리고머가 exon51번의 특정 부위를 마스킹하게 해 버린 것이다.

 

Screenshot 2014-08-14 at 09.29.30 오후

결과는 아쉬운데로 만들어진 단백질이 부분적으로나마 기능을 했다. 환자입장에서는 DMD 환자가 임상적으로 훨씬 양호한 BMD환자가 되는 것이다.

 So What? 이 Why not으로 바뀐 순간이다. 

 

이게 바로 Antisense-mediated exon skipping이 된 것이다.

Antisense(줄여서 ASO AntiSense Oligonucleotide 라고도 하고 AON- Antisense OligoNucleotide라고도 한다)를 이용해서 DMD gene을 가지고 exon skipping이 어떻게 되는지를 연구했다… 어마어마하게…

그래서 봤더니 exon skipping이  exon-intron 연결부위의 염기서열들이 중요한 역할을 하는 것 이외에 exon 중간에도 exonic splicing enhancer(ESE) 부위가 있어서 여기를 ASO로 막아도 splicing이 건너뛰기 하는 것을 발견하게 되었다. 나중에 알고 보니 이 부위에 RS 단백질들이라는 단백질들이 결합을 하면 exon으로 인식을 해서 Spliceosome이 그 전후를 짜른다는 것도 알게 되었다. 또 보니 intron 내부에도 소위 exon definition에 중요한 역할을 하는 부위도 있다는 것을 알게 되었다.

이런 과학적 기반을 가지고 DMD를 치료하기 위해서..exon-skipping을 하게 하는 antisense를 만들어 임상을 하는 회사들이 생겼다.

요즘 이런저런 이유로 꽤 유명해진 Sarepta라는 미국 회사와 Prosensa라고 하는 네덜란드 회사이다.

[물론 DMD라는 질환과 관련하여서는 PTC Therapeutics를 빼고는 말할수 없지만, 이 회사는 exon skipping 작용기전이 아니고 NMD(nonsense-mediated decay) 현상을 이용한 것이어서 여기서는 논하지 않기로…]

우선 두 회사의  DMD 관련 선두제품을 비교해 보자.

Slide8

 

Prosensa의 drisapersen은  2009년 당시로서는 나쁘지 않은 계약조건으로  GSK에 license-out이 되어 GSK2402968이라는 프로젝트 코드명까지 받았지만, 올해 1월 GSK가 권리를 다시 Prosensa에게 돌려주었다. 임상 3상 결과가 실망스럽다면서… 그런데 불과 몇달 후 Prosensa는 같은 임상실험 결과 분석을 토대로 미국  FDA로부터 breakthrough designation(혁신신약지정)을 받아서 세상을 놀라게… 특히 GSK 를 놀라게 했다.

약물을 자세히 보면 일단 DNA구조를 근간으로 하되, phosphodiester backbone을 약간 바꾸어서 phosphorothioate backbone으로 하였다.

phosphodiester vs phosphorothioate linkages 495x267

그리고 약물의 투여용량과 투여 경로 측면에서 보면 6mg/kg의 용량으로 피하주사를 한다. 이점은 Sarepta의 eteplirsen 의 30~50 mg/kg 용량을 60분간의 iv infusion투여하는 것에 비해서는 상당히 환자편의성 측면에서는 좋다고 보여진다.

Sarepta Therapeutics는 최근 CTO와 CEO간의 불화로 CTO가 퇴사하는 등 시끌시끌하지만, 연구결과는 조금씩 앞으로 나가고 있다.

약물을 자세히 보면 일단 DNA 나 RNA의 5각 라이보즈 고리가 아닌 육각고리를 이용하고 있고 Phosphate의 음전하를 줄이기 위해 dimethylamine을 도입한 Morpholino구조를 하고 있다.

eteplirsen

복용량측면에서는 30-50mg/kg에, 매주 한번씩, 60분간 정맥투여를 해야 하기 때문에 환자-특히 아동 측면에서는 볼편함이 있다고 보여진다. 하지만 DMD가 워낙 생명의 위협이 있는 질환이라 큰 약점으로 작용하지는 않을 것이다.

 

Exon Skipping은  DMD 질환에 가장 많이 적용되고 있지만 이 질환 이외에도 다양한 표적에 대해서 가능성 탐색이 이루어지고 있다.

Screenshot 2014-08-14 at 10.50.55 오후

 

원래 Antisense (ASO)는 mature mRNA의 특정부위에 결합해서 Ribosome이 mRNA를 읽어내려 가는 것을 steric block방식으로 막으면서 RNA:DNA duplex를 끊어내는 RNase H의 작용으로 해당 mRNA를 분해하는 방식으로 기대했었는데, 원래 의도했던 방식보다는 최근에는 exon skipping을 유도하는 목적으로 더 주목을 받고 있다.

즉, 작용의 무대를 cytosol에서 nucleus안으로 바꾸어 경기를 하고 있는 셈이다.

siRNA나 microRNA가 세포내 작용 공간을 cytosol로 하고 있는 반면 ASO는 세포내 작용 공간을 세포핵으로 했으니 흔히 말하는 RNA interference와는 상당히 차별화된 작용기전을 가지게 된 셈이다. 동일한 핵산기반 신약이어도 둘은 이제 완전히 다른 부류가 되어버린 것이다.


source: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17684229, wikipedia, company homepage…etc

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