Antisense가 경구로 ??? 업계의 황당함이란…

올해 4월 24일 셀진 Celgene이 안티센스 제품 하나를 업프런트 7.5억불 (약 8천억원)을 주고 전세게 실시권을 취득했다. 

 

해당 제품 License Product: GED-0301(generic name : mongersen)

개발회사 Licensor: Nogra Pharma Limited (아일랜드 회사)

개발단계 Stage of devlopment: P2 완료단계

적응증  Indication: Chron’s desease  외

Upfront: $750m

Development and regulatory milestone: $815m

Sales (or commercial) milestone: $1,050m

 

그런데 특이한 점은 Nigra가 21개짜리 핵산올리고를 경구용으로 개발하고 있다는 것이다.

이에 대해 심지어 전문 블러거도 떄딱한 눈으로 보고 있다.

1) 1세대에 해당하는 phosphorothioate chemistry이다.

2) 표적은 smad7이라는 단백질을 발현하는 유전자이다.

3) 전임상 모델에서 효력이 있다는 논문이 나왔다.

Inhibition of Smad7 with a specific antisense oligonucleotide facilitates TGF-beta1-mediated suppression of colitis.

4) 임상1상에서 15명의 크론씨병 환자를 대상으로 안전성테스트를 했다.

– 일일 1회 7일간 복용

– 용량은 40, 80 그리고 160 mg/day

– 대체로 환자들에서 큰 부작용없었다.

위와 같은 자료가 있지만, 전문 블로거라고 할 수 있는 Dirk Haussecker 도 딱히 믿지는 못하겠지만, Celgene이 거금을 베팅했으니 그런가 보다 하는 것이다.

 

비밀은 21개짜리 안티센스 올리고를 위에서 버티면서 대장에서 방출이 되도록 enteric coating을 한 것이다.

생각해보면 CD나 Ulerrative Colitis가 굳이 약물의 전신분포가 필요없고 장내에서만 작용해되 된다는 점이 명확한데… 그걸 생각을 못했을까 생각케 한다.

 

사람들이 처음에는 셀진이 미쳤다고 생각했는데 임상2상 데이타 주요 결과만 발표했는데, 셀진 주가는 적절하게 올라줬다. 사람들이 이제 끄덕이는 분위기이다. 

결과는 아래와 같이 정리된다.

 

INTRODUCTION/OBJECTIVES:

Crohn’s disease (CD)-related inflammation is characterized by defective activity of the immunosuppressive cytokine transforming growth factor (TGF)-β1, due to high Smad7 (an inhibitor of TGF-β1) signalling. The effects of an oral, topically active Smad7 antisense oligonucleotide, Mongersen, were evaluated in a phase II study in patients with active CD.

AIMS & METHODS:

In a double-blind, placebo-controlled trial, the efficacy of Mongersen as induction therapy was evaluated in steroid-dependent or steroid-resistant patients (utilizing ECCO consensus definition) with active CD (CD activity index [CDAI] score 220-400). Patients were randomized to Mongersen 10, 40 or 160 mg/day or placebo for 2 weeks. The primary outcomes were clinical remission (CDAI score <150 at Day 15 and maintained for ≥2 weeks) and safety. Secondary endpoints included clinical response (CDAI score reduction of 100 points) at Day 28.

RESULTS:

Clinical remission was achieved by significantly greater proportions of patients receiving Mongersen 40 (55.0%) and 160 mg/day (65.1%) compared with placebo (9.5%; p<0.0001 for both). No significant difference in clinical remission was seen for 10 mg/day (12.2%) vs. placebo. The rate of clinical response was significantly greater among patients receiving 10 (36.6%), 40 (57.5%) or 160 mg/day (72.1%) of Mongersen vs. placebo (16.7%; p=0.039, p=0.0001 and p<0.0001, respectively). The rates of adverse events (AEs) and serious AEs (SAEs) were similar across groups. Nine SAEs occurred in 6 patients (placebo, n=1; Mongersen 10 mg, n=3; 40 mg, n=1; 160 mg, n=1). Most SAEs consisted of hospital admissions for CD-associated complications or symptoms, and included: pyrexia and cough (placebo); abdominal pain (n=2), CD worsening and pyrexia (Mongersen 10 mg); seton placement for perianal fistula and surgery for hemorrhoid thrombosis (Mongersen 40 mg); and thermal burn (Mongersen 160 mg).

CONCLUSION:

Induction therapy with orally administered, topically active Mongersen for CD was well tolerated; toxicities previously reported with systemically active antisense agents were not observed. Mongersen treatment resulted in significant improvements in clinical remission and response rates within 4 weeks of initiation of treatment (EUDRACT NUMBER 2011-002640-27).

 

이 결과는 어찌보면 Chemistry의 승리가 아니고 완전 disease biology의 승리라는 생각이 든다.  전혀 특별하지 않은 안티센스를 가지고 적절한 적응증에 대해서 적절한 제형을 만들어 대박을 냈다.

 

 

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RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(6)

먹는 놈(들)…

오늘은 현재 NAT 분야에 있는 회사들에 대한 간략한 소개를 하려고 한다. 국내의 회사들도 몇개 소개하려고 한다.

Slide1

이미 한번 올린 도표이지만, 2014년 8월 16일 현재 전세계 (사실 대부분 미국 NASDAQ)에 상장된 회사들의 시가총액을 합하면 약 133억불 (약 14조원 정도)이다.  아직 NAT분야에서 허가받은 치료제는 2개 밖에 되지 않고, 그 매출이 거의 미미하지만,  이 분야의 미래를 보고 투자하는 사람들이 상당히 많은 편이다.   [물론 항체에 투자하는 비중에 비하면 아직 많다고 할수는 없다]

위의 그림에 열거된 회사들 이외에도 비상장 회사들은 아래와 같다.

Benitech Biopharma, Quark pharmaceutical, EGEN, Ichor Medical System, Somagenics, Biomics Biotechnology, iTherapeutics, CureVac, Boston Biomedical, Moderna Therapeutics, Zata Pharmaceuticals, ProNAi, Divergence, inteRNA Technologies, Sylentis, Groove Biopharma, PhaseRx…. [여기에 나열되지 않은 회사들을 다 포함하면 혹자는 약 200여개의 NAT (antisense, exon-skipping, siRNA, microRNA 등] 회사가 있다고 한다.

국내에는 NAT를 전면에 내세우고 하는 회사들이 몇개 있다.

바이오니아: siRNA 회사이다. [코스닥 상장법인] 치료제 중심

http://www.bioneer.co.kr/home.aspx

명실상부한 국내 1호 바이오벤처이고, 2005년말에 KOSDAQ에 상장을 한 국내의 대표적인 바이오벤처이다.

1992년 설립시의 이름은 (주) 한국생공으로.. 이름에서도 알수 있듯이 당시 출연연구소인 생명공학연구소 출신의 박한오 박사가 설립한 회사이다.  초기에는 연구기자재 및 시약등의 국산화에 주력하면서 점점 올리고를 합성해서 연구실에 제공하는 업무를 하였고 2000년도 벤처 붐을 타면서 비상장 상태에서 시가총액 4천억원으로 투자를 받는 등, 엄청난 위용을 자랑했던 회사이다. [연혁은 여기 참고하시길….]

다양한 올리고를 만들어 연구용시약으로 제공하면서 올리고 관련 노하우가 축적되고 그 기반위에서 독자연구를 통해서 현재 siRNA의 세포내 전달을 효율적으로 하는 SAMiRNA라는 기술을 확립하여 현재 Sanofi와 협력을 하고 있는 회사이다.

SAMiRNA는 Self-assembled-micelle-inhibitory-RNA의 약자로 스스로 마이셀이되도록 모이는 siRNA 정도로 한글로 풀어볼 수 있을 듯 하다. 여기서 inhibitory RNA라고 한것은 siRNA를 의미한다고 봐야 할 듯….

일반적으로 siRNA의 세포내 전달 효율을 높이기 위해 생체네 세포막과 융합이 되도록 하는 마이셀을 만들어주는데, 이 마이셀을 만드는 공정이 꽤나 번거롭고, 전체 수율을 떨어뜨리는 공정이다.

그런데 바이오니아는 siRNA의 말단에 micelle 을 형성할 수 있는 물질을 달아서 수용액 상태에서 스스로 마이셀이 되도록 하는 기술을 개발한 것이다.

회사 홈페이지에 나오는 기술의 장점을 정리한 것은 아래와 같다.

Screenshot 2014-08-21 at 12.29.48 오후

지켜볼 일이다.

BMT Inc: siRNA 회사이다. [비상장] 치료제 중심

성균관대학교 화학과의 이동기 교수 [현재 RNAi 신약개발 글로벌 연구실을 책임지고 있음]가 과학적 설립자로 되어 있는 바이오벤처이다. 최근에 VC들로 투자를 받고 본격 확장을 한다는 소식을 들었다.  siRNA의 안전성을 높이고 효율을 높이는 기술로서 asymmetic siRNA를 개발하였다고 한다 [아래그림 참고] 보통 21 nt가 두개 붙어 있는데 한쪽을 좀더 길게 해서 장점을 만는 시도이다.

Screenshot 2014-08-21 at 12.40.00 오후

개인적으로 많은 정보가 없어 이 정도 소개밖에 할 수 없다….

지켜볼 일이다.

올리패스: http://www.olipass.com/ [비상장] 치료제 중심

올리패스는 설립시에는 CTI BIO라고 이름하였다가 2012년 이름을 바꿔 OliPass Corporation이 되었다.

(주)태평양에서 신약연구개발 책임자였던 정신 박사가 2006년도에 설립한 회사로 phosphorotioate chemisty와는 완전히 다른 PNA를 백본으로 하면서 핵산부분을 변형해서 세포투과성을 높이는 기술을 가지고 있다고 한다.  자세한 내용에 대한 공개가 되어 있지 않는 회사이다.

이외에 파나진(PanaGene)이라는 회사가 있는데 PNA를 이용해서 주로 진단분야에 응용하는 회사이다.우회등록을 통해서 코스닥에 있다가 최근에는 비상장 상태로 돌아갔다. 제놀루션이라는 회사도 알려져 있으며 주로 진단분야에서 siRNA를 활용하는 것으로 알려져 있다.

기타 다른 기업들이 있을 수 있으나, 치료목적으로 진행하는 회사들은 이 정도로 알고 있다.

아쉽게도 아직 국내에 microRNA 관련 회사는 없는 것으로 알고 있다. 과거 10년간의 RNA 분야의 혁명을 주도한 microRNA 관련한 회사가 몇개는 나오는 것이 맞을 듯도 한데… 아쉽다…

또 아직 전통적 제약회사들 중에 NAT 관련 분야를 의미있게 하는 곳이 없는 점도 아쉽다. 국내 제약회사라는 것이 사실 연구력만 보면 미국의 자리잡은 바이오텍 수준 (?) 정도면 잘하는 것인데… 좀더 혁신적인 분야에서 열심을 내야하지 않을까 생각한다.

몇번 이야기했지만, 생물학적으로는 과거 10년 사이에 RNA biology에 대해 엄청난 진전이 있었지만 nucleic acid chemistry 측면에서는 그리 큰 진전은 없었던 듯 하다.  이 분야에서의 새로운 혁신이 뭔가 큰 변화를 몰고 올 수 있다는 조심스런 예측을 해 본다.

COI(conflict of interest) disclosure:   필자는 올리패스의 사업개발자문으로 있다.

RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(5)

먹는 놈(들)…

오늘은  siRNA와  microRNA가 어떤 차이와 장단점을 가질 수 있는지에 대해 이해하기 위해 좀 과학적인 이야기를 해야겠다.

 

우선 둘간의 공통점을 보면 아래와 같다.

1. 세포내에서 mRNA에 결합하여 작용한다.

2. 크기가 21 nt 전후이다.

3. RISC에 구성요소인  argonaute이라는 단백질에 단일가닥(single strand)로 결합한다.

4. RISC 결합하기 전까지는 RNA duplex로 있다.

이를 설명하는 좋은 그림들이 많이 있다. 아래를 한번 보자.

Source: He L, Hannon GJ. “MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation”. Nat Rev Genet. 2004;5(7):522-31

Source: He L, Hannon GJ. “MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation”. Nat Rev Genet. 2004;5(7):522-31

우선 siRNA는 기본적으로 외부에서 침입하는 유전자들에 대한 방어 기전(defense mechanism)이다. 외부에서 침입하는 duplex RNA를 인식한 후 깍두기 자르듯 일정 크기로 잘라서 (Dicing) 그 중 하나의 가닥이 Argonaute과 결합하면… 결합된 21개까지 siRNA가 Argonaute을 포함하는 RISC 를 자신이 왔던 duplex RNA로 인도하게 된다. 그리고는 자신의 애비(?)를 막 자르게 한다.

방어기전이니 목적은 해당되는 표적  mRNA를 아예 없애버리는 것이다.

이에 반해서 microRNA는 원래부터 genome에 있는 것으로 목적이 단백질의 생산 정도를 아주 미세하게 조절하기 위한 것이다. 단백질 생산이야 mRNA의 양을 조절하면 어느정도 조절되지만, microRNA 때문에 하나의 mRNA가 매우 많은 숫자의  microRNA의 영향을 받아 매우 미세하게 단백질 생산의 양을 조절하게 된다.  보통 microRNA는 mRNA 상의 3’UTR상에 결합하는데 – 3′ UTR에는 여러개의  서로다른 microRNA가 결합할 수 있는 sequence들이 있다 – 이렇게 결합하게 되면 mRNA는 없어지지는 않고 모양의 변화를 좀 주어서 하나의  microRNA 결합당 단백질 생산을 1.5~2배 정도 줄어들게 – 그러니까 30~50% 정도 생산을 줄이게- 한다. 여러개의 microRNA가 결합하면 곱하기 식으로 더 생산을 줄인다.

 

여기서 만들어지는 과정을 microRNA를 기준으로 한번 자세히 보자….

microRNA는 세포 핵 안에서 유전체로부터 전사(transcription)된 후 Drosha라는 핵산가수분해효소(Rnase III,  즉 ddRNA만을 자르는 핵산가수분해효소)에 의해 머리핀(hairpin) 구조로 만들어지게 되고, exportin5라는 단백질에 의해서 핵에서 세포질로 이동하게 된다.    [Drosha는 한국의 자랑스러운 여성과학자인 김빛내리교수가 밝혀낸 microRNA 생성과정의 핵심이다. 홈페이지를 가면 매우 microRNA관련 많은 정보들이 있다]

세포질에서 Dicer(dice의 뜻이 깍두기썰듯 썰다…이므로 깍두기라고 번역하면 어떨까 한다)에 의해서 모리핀 모양의 머리부분이 잘리게 되고 RNA duplex가 된다.

RNA duplex가 argonaute라는 단백질에 결합하여서 그 이중 가닥 중 하나가 떨어져 나가면 RISC(RNA-induced silencing complex)가 완성된다. 이제 21개짜리 RNA는 염기서열상 상보적인 mRNA의 위치를 찾아갈 준비가 다 되어있다.

여기서 siRNA는 핵안에서 가공되는 과정이 없이 세포질에서 바로 깍두기(Dicer)를 만나게 된다. 그 다음부터는 동일하다.

 

결국 siRNA와 microRNA는 세포질에서 가공되고 RISC까지 장착되는 순간까지는 동일한 운명을 겪게 된다.


 

그럼 siRNA와 miRNA의 차이점을 중심으로 비교를 해보자.

Slide5

miRNA는 RISC에 장착된 이후 표적 유전자의 3’UTR에 있는 상보적인 염기서열을 찾아간다. 그런데 miRNA가 3’UTR의 결합할때 관여하는 염기서열은 전체 길이(21개 전후)에서 일부인 5’쪽의 2-8번까지 대략 7개 정도 밖에 없다. 다른 부위들은 결합에 거의 관여하지 않는다…이렇게 전체 21개 길이 중에 일부만 관여를 하기 때문에 하나의 표적 mRNA가 아닌 다수의 표적 mRNA에 결합하게 된다.

반면 siRNA는 보통 21개 염기서열 전체가 결합에 관여하게 됨으로써 특정  mRNA만과 결합하려고 의도하여 만들어진다. 그런데 사람이 이렇게 만들었다고 세포가 말을 듣는 건 아니니… 21개가 전체 관여해서 정말 특정 유전자의 mRNA에 붙지만, 마치 miRNA의 RISC처럼 작용해서 7개만 결합에 관여해서 다양한 mRNA들에 의도하지 않게 결합하여 off-target effect를 만들어내기도 한다.

siRNA와 miRNA의 더 큰 차이는 결합이후의 결과이다.

siRNA는 기본적으로 표적  mRNA를 제거하는게 목적인지라 RISC의 endonuclease activity를 사용해서 mRNA를 반토막 내버린다. 그리고는 다른 nuclease들이 와서 해당 mRNA를 완전히 없애 버린다.

반면 miRNA는 목적이 단백질 생산의 미세 조정인지라… 3’UTR에 결합한 후 Ribosome complex와 상호작용을 해서 단백질 생산양을 1.5~2배 정도 저하시킨다. 즉 30~50% 정도 줄이게 하는 것이다. 만일 여러 종류의  microRNA가 한 유전자의 mRNA 3’UTR쪽에 결합하면 더 많이 단백질 생산을 줄이게 된다. 하지만 대부분의 경우는 mRNA는 아직 말짱하게 있다.

그리고 하나의 microRNA가 결합하는 표적  mRNA들은 작게는 몇개에서 많게는 수십개가 된다. 동시에 한 유전자 mRNA에 보통 여러개 (종류)의 microRNA 가 결합하게 된다. 매우 복잡한 경우의 수들이 만들어지게 된다.

이런 측면에서 암세포가 만일 특정 유전자를 많이 만들어 낸다면 이때는 siRNA 를 써서 해당 유전자의 mRNA를 완전히 잘라버리면 좋다. 반면 대사질환과 같이 여러 유전자들이 관여를 하면서 과발현차이가 크지 않을 경우는 microRNA를 이용해서 여러 해당 유전자들을 약간씩 줄여주는 것이 안전할 수 있다.

 

이렇게 siRNA와 miRNA, 특히 miRNA는 RNA로서 생체내에서 매우 놀라운 일들을 하게 된다.

 

그럼 우리 몸안에  microRNA는 몇가지나 있을까?

우선 몸안에서 전사(trascription)되는 small RNA 중에 한 정도는 microRNA이고, 현재까지 알려진 사람의 microRNA는 약 2천여종이 된다고 한다. 이 숫자는 계속 늘어나고 있다.

참고로 우리 몸안의 유전자들 중에서 약 50%가 microRNA에 의해서 단백질 생산량을 미세조정한다고 한다.

이외에도 microRNA는 몸 안에서 매우 놀라운 일들을 한다. 최근에 다수의 유용한 YouTube가 있으니.. 아래에 열거함으로써 마무리하고자 한다.

 

 

혹시 리뷰를 보고 싶으시면 아래의 논문을 한번 보면 좋을 듯하다.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2675692/

RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(4)

먹는 놈(들)…

오늘은 2000년대 이야기이다. 제목은 먹는 놈(들)이지만, 과연 NAT기술이  log phase(초기단계 혹은 정체단계) 단계에서  tipping point (전환점)를 지나서 본격적인 성장단계를 거치고 있는지는 사실 의문이다.

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아래의 그림을 보면 현재 나스닥 및 주요국가의 증권시장에 상장된 공개기업의 시가총액을 기준으로 한 NAT 회사들의 한 단면이다.

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상장되어 있는 NAT 회사들의 시가총액의 합은 $13.3 billion (한화 기준 약 14조원이다) ISIS가 설립된지 25년이 지났지만 아직도 가능성으로 남아 있다고 보아야 한다.

개별기업으로 보면 siRNA를 주로 하는 Alnylam 이 51억불로 가장 많고, 그 다음이 antisense를 주로 하는 ISIS가 42.5억불로 2위이다.  그 다음을 antisense를 이용한 exon-skipping을 주로 하는 Sarepta (원래는 AntiViral Ins –> AVI BioPharma –> 2012년 이름을 Sarepta로 바꿈)가 9.2억불,  siRNA(small interfering RNA)를 주로 하는 Arrowhead Reserch가 7.2억불로 그 뒤를 따르고 있다. miRNA(micro RNA)를 주로 하는 Regulus의 경우 작년에 성공적인 IPO를 하기는 했지만, 아직은 임상제품이 없는 점을 고려하면 3억불의 시가총액이면 준수하다고 봐야 한다.

기업의 역사들을 고려한다면 전통적인 antisense 회사들보다는 siRNA 회사들이 상대적으로 평가를 잘 받고 있다고 봐야겠다.

NAT분야 전체에서 허가를 받은 제품은 전통적인 antisense인 formiversen과 mipomersen 두가지로 모두 ISIS의 제품이다.  그 다음을 따른 것은 antisense이되 exon skipping 기작으로 작용하는 Prosensa의 drisapersen (MDM 치료제) 과 Sarepeta의 eteplirsen이 있다. 그 다음을 siRNA들이 따르고 있다.

여기서부터 키운놈들과는 다른 먹는 놈들 -최소한 먹기를 원하는 놈들-을 좀 보아야 겠다.


앞에서 설명한 phosphorothioate chemistry 나 Morpholino chemistry 등 핵산가수분해효소에 저항성이 있으면서 결합력이 개선되고, 또한 세포투과성이 개선된 변형된 핵산들을 사용하는 치료제들은 몇가지로 구분될 수 있다.  즉, 사용하는 chemistry에 따른 구분이 아닌, 세포내에서의 작용기전에 따른 구분이 몇가지가 된다.

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전통적인 antisense : 주로 phosphorothioate chemistry를 사용하면서 약물의 크기는 다양하지만 30 nt 이하이다. 보통 단일가닥 형태로 주사하게 되고, 그 작용기전은 염기서열이 상보적인 mRNA에 결합해서 DNA:RNA duplex를 형성하고, 이런 DNA:RNA publex만 인지해서 RNA만 자르는 Rnase H에 의해서 mRNA부분이 잘려나가게 유도하는 약물들이다. 개념상으로는 가장 원시적인(?)-초기에 제안된 작용기전의 약물로 현재 ISIS가 주도하면서  mipomersen이 두번째로 2013년도에 FDA 허가를 받았다.

Exon-skipping antisense : 전통적인 antisense가 가공이 끝난 mRNA에서 작용하는 반면 exon-skipping antisense는 splicing이 일어나기 전 상태인 pre-mRNA상의 특정 염기서열 부위에 결합해서 표적으로 하는 엑손이 splicing-in되지 않도록 함으로써 PTC(premature termination codon)을 건너뛰게 하거나 open reading frame (ORF)를 회복시켜주는 작용을 한다. 주로 유전성 희귀질환에 적용되고 있고 Prosensa와 Sarepta가 주도하고 있다. 참고로 Prosensa는 phosphorothioate chemistry를 Sarepta는 morpholino chemistry를 각각 사용한다.

siRNA: 약 21개 nucleotide 길이의 double-stranded RNA 변형체를 넣어주어 두가닥의 RNA 중 하나가 세포내의 RISC (RNA-induced silencing complex)에 결합하고, 이 siRISC -여기서 siRISC라고 하는 이유는 siRNA에 의한 RISC란 뜻으로 microRNA에 의한 RISC인 miRISC와 구분하기 위한 것- 가 siRNA염기서열과 정확하게 상보적인 염기서열을 가진 mRNA에 결합하게 한다… .이렇게 결합되면 siRISC는 해당 mRNA를 endonuclease activity를 이용해서 잘라버린다. 결국 표적으로 하는 mRNA를 줄여준다.

miRNA: microRNA를 이용한 치료제는 원하는 microRNA 혹은 표적으로하는 miRNA와 상보적인 anti-miRNA oligo를 세포내에 넣어줌으로써 약효작용을 낸다. miRNA가 RISC와 결합하고 그 길이가 21nt 전후인것은 siRNA와 동일하지만, siRNA는 특정 하나의 유전자를 표적으로 하고 (최소한 의도는), miRNA는 꽤 많은 유전자를 표적으로 한다 (이건 사람이 의도한게 아니고 microRNA의 기본적인 특징이다). 그래서 최근에는 microRNA가 특정 질환 혹은 상태와 관련이 되는 다양한 유전자의 번역(translation)을 동시에 조절해 준다는 측면에서 복잡한 복합유전자 관여 질환에는 더 적절하다는 평가와 함께 더 많은 주목을 받고 있는 것이 사실이다.

miRNA: 특정 miRNA를 넣어주면 RISC와 결합하여 miRISC를 형성하고, 보통 다수의 유전자의 mRNA의 3’UTR(untranslate region)에 결합함으로써 표적 mRNA의 단백질 생성을 저해한다.

anti-miRNA oligo: miRNA와 상보적인 서열을 가진 핵산으로 세포내에서 표적 miRNA가 RISC와 결합하는 것을 방해 함으로써 해당 miRNA가 단백질 생성을 억제하는  mRNA들이 방해받지 않고 단백질을 생산하도록 해준다.

위에서 알수 있듯이 siRNA나 miRNA는 모두 길이가 21nt  전후로, 세포 내로 주입이 되면 RISC라는 단백질복합체와 결합하여 작용을 한다.  이 부분에 대해서는 꽤나 복잡한 과학적인 이야기를 해야 한다. 바로 여기서부터가 진짜 RNA world가 열리는 시점이다.

[새로운 RNA world는 다음 글에서 주로 과학적인 측면에서 이야기를 하겠다]

여기서 각 접근방법에 따른 장단점을 좀 보겠다.

Slide1

4가지 전체에 적용되는 특징은 아래와 같다.

1) 높은 생산단가. phosphorothioate  이건 morpholino이건 아니면 locked nucleic acid이건 생산단가가 매우 높다… 보통 그램(gram)당 수천 $에서 수만 $ 한다. traditional antisense인 mipomersen(Kynamro)의 경우 주당 200mg이면 연간기준으로는 10 그램 정도를 소모하게 되는데 흔히말하는 원료의약품의 원가만 일만불 이상이 된다. 결국 업계 평균적인 원가구조를 대입하면 약가가 최소한 10만불이상이 되어야 한다는 것이다.

2)  표적 장기 분포율과 세포투과율 두가지 측면에서 아직도 제한적이다. 다양한 장기로의 분포가 아직도 제한적이고, 세포투과율이 아직도 아쉽다. [이점은 위의 투여량 200 mg이 인체 내 세포당 분자 몇개에 해당하는지를 계산해보면 알게된다.]

위의 공통적인 단점에 더해서 siRNA 는 세포투과율이 좀더 않좋기 때문에 delivery 가 더 큰 관건이 되고 있다.

Antisense, exon-skipping, 그리고 siRNA는 모두 특정 유전자 하나만을 조절하는 작용기전이다. 이에 비해서 micro RNA는 작으면 수가지 많으면 수백가지의 다른 유전자의 mRNA에 동시에 작용한다.  여기서 siRNA의 고민이 하나 있다. siRNA가 21 nt로 microRNA와 유사하고 RISC에 결합하기 때문에 원하지 않게 마치 microRNA처럼 작용을 해서 원하지 않는 표적유전자들의 mRNA에 대해서 작용을 하는 경우들이 있다.

결국 유전자 특이도라는 측면에서는 antisense 및 exon skipping이 훨씬 우수하다. 하지만, microRNA는 특정 질환 혹은 상태 관련 유전자들을 한꺼번에 조율된 형태(orchestrated manner)로 조절하기 때문에 좀더 조율도면서 광범위한 효과를 얻을 수 있다는 측면에서 장점이 있다. 중간에 낀 것이 siRNA라고 할 수 있겠다.


사실 NAT는 “mRNA 중간에 알박기를 해서 단백질 생산을 방해하겠다”는 아주 단순한 생각으로 시작했는데.. 연구를 해보니 이게 그렇게 간단하지 않다는 것을 알게 되었다. 그 과정에 micro RNA도, siRNA도 그리고 antisense-mediated exon skipping이라는 현상도 모두 알려지게 되었다.

 

지금 필자는 향후 NAT 관련하여 진정한 승자는 antisense-mediated exon skipping과 micro RNA가 좀더 많은 주목을 받으며 광범위한 응용분야를 가지지 않을까 생각한다. 단, 여기서도 NAT 분자의 기본적인 특성 떄문에 (최소한 현재까지는) 특정 장기 (간, 비장 등)에 많이 분포되고 – 거꾸로 말하면 다양한 장기에 분포되기 쉽지 않고- 또 세포투과율이 아직도 개선의 여지가 매우 많은 점…. 그리고 NAT의 생산원가가 상당히 높다는 것 등이 해결되어야 할 것 같다.

이러한 breakthrough는 생물학자들이 할게 아니고 새로운 형태의 화학분자를 만들어야 하는 화학자들 – 특히 유기화학자들의 역할일 것이라 생각한다.

RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(3)

키운 놈(들)…

오늘은 두번째 기간인 90년대에 대해 이야기 두번째 편…. 숨은 공로자를 빠뜨리면 안된다.


가끔 나라 이름을 보면 여러가지 생각이 든다.

우리가 미국으로 부르는 나라의 공식이름은 “the United States of America”… 그런데 별로 기분이 좋지 않다… America에는 분명 중미에 있는 나라들도 있고, 남미도 어엿이 있는데.. 한 나라가 ‘the United States of America”이면 그럼 딴 나라들은 ” the Scattered Ttulguji(떨거지) States of America 아메리카 떨거지국가”들인가? 만일 우리나라가 이름은 “아시아 공화국”이라고 지으면 아시아의 딴 나라들이 뭐라고 할까?

이런 USA를 일본은 “쌀나라”라고 부르고 한국은 “아름다운나라”라고 부른다.. 이런거 보면 우리나라 사람들 마음이 참 곱다.

이런 착한 마음은 미생물에게도 적용되나보다… 오늘의 주인공은 “예쁜꼬마선충” ….

이런 아름다운 이름을 붙은 것은 유전학자들이 이녀석을 데리고 한국에 와서 어느 기생충학자(한림대 기생충학 교실의 허선 교수님)에게 이름을 붙여달라고 했는데, 그 기생충학자의 부친이 국문학자여서 두분이 이름을 이렇게 붙여줬다고 한다.  “쌀벌레”가 아니고 “예쁜꼬마벌레”라고 지어 줬으니… 마음씨 이쁘게 쓰는 우리네 조상들 닮았다.  [참고로 C. elegans의 “elegans”는 우리가 흔히 엘레간트하다 혹은 엘레강스 하다고 할 때의 elegance에 해당하는 라틴어라고 한다.]

 

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 선충(nematode)는 실모양의 벌레라는 뜻으로 선충으로 분류되는 벌레는 수천종에 이른다. 약 40%는 토양에 살고, 40%는 수중에 나머지 10%씩들은 동물이나 식물에 기생하며 산다.

우선 이 꼬마선충은 있을게 다 있는 어엿한 동물이다.  유전자 수만 본다면… 잘났다는 인간에 비해 약간 부족하지만… “인간중에도 좀 모자란 사람들이 있음을 감안한다면” 피장파장이다.  비록 유전체의 크기는 30억개 vs. 1억개로 1/30이지만, 유전자 수는 25,000 대 19,000..

 

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 또한 몇가지 다른 이유에서도 유전학연구의 모델동물로 아주 좋다.

 

1. 크기가 작지만 현미경으로 관찰하기 좋다.

 큰 녀석이 1mm정도로서 눈으로 보기는 작지만, 좀 배율이 있는 현미경으로 보면 움직이는 것이 잘 보인다.

2. 키우기 쉽다 (먹이).

원래가 토양에서 미생물을 먹고 자라는지라, 실험실 접시에다가 “먹이 – 대장균”만 넣어주면 혼자 잘 자란다.

3. 키우기 쉽다 (이성교제??)

자웅동체-한 개체에 정자와 난자 다 가지고 있는 경우-라서 혼자서 북치고 장구치고 애기까지 낳는다. 대략 한번에 300쌍둥이 정도.

[참고로 자웅동체의 개체가 대부분이지만, 가끔 수컷들도 있다고 한다]

4. 키우기 쉽다 (빨리 자란다)

아래의 그림에서처럼 22도씨 기준에서 대략 54시간 정도면 알에서부터 성체까지 다 자란다.

C.elegans의 생애 주기

5. 개체를 구성하는 세포들이 잘 알려져 있다

인간들과 같이 복잡하지 않아 다자란 성체를 구성하는 세포수가 잘 알려져 있다. 959개….  그런데 이 959개 가지고 할건 다한다. 돌아다니고, 먹고, 놀고…. 애기까지 낳고….  [수컷 개체의 경우는 1,031개라고 한다… 거시기만드느라 숫자가 많아졌나?] 이렇게 숫자가 작으니 수정체로부터 세포가 분화되어 어떤 역할을 하는 장기에 해당되는지를 족보로 그리기 까지 했다.

C. elegans 세포 계보

그런데도… 유전자 수는 사람과 대략 비슷하다고 할 수 있으니…

 

이 “예쁜꼬마선충”의 90년대 활약은 가히 눈부시다고 할 수 있다.

첫 microRNA의 발견을 온 몸으로 밝혀냈고, 첫 siRNA의 발견도 온 몸바쳐 밝혀냈다.  [siRNA 그리고 microRNA에 대해서는 다음 호에 자세히].. 결국 그 전까지만 해도 복사기 역할만 한다던 RNA의 세계에 생명을 불어넣어주고…. 우리가 전혀 몰랐던 RNA의 역할들을 알려주었다.

아마 이 “예쁜꼬마선충”이 없었다면 RNA의 신세계는 열리지 않았거나, 엄청나게 많은 시간이 걸렸을 것이다.

Stanley Crooke가 Chemistry라는 측면에서 NAT분야를 키워냈다면 “예쁜꼬마선충”은 멍청한 사람들의 제한된 “paradigm”을 깨기 위해 온몸으로 “NAT” 와 관련된 새로운 “생물학”을 키워 냈다.

지금 돌이켜 보면 Dr. Paul Zamecnik의 단순한 생각.. 즉 hybridation을 통해서 mRNA의 단백질 생산을 막겠다고 시작한 NAT (초기에는 이름도 촌스러운  anti-sense 한국말로 바꾼다면 “반상식”이라고 해야하나???ㅋㅋㅋ)에 놀라운 자연의 숨은 그림들을 밝혀준 것은 바로 이 “예쁜꼬마선충”이다.

 

그래서 “예쁜꼬마선충”도…… NAT를 키운 놈이다.

 


 

Source: 여기저기 많이 했는데…

1. http://www.kormb.or.kr/home/kor/Newsletter/Files/20120127/120127_162446274.pdf

2. http://soldier122.egloos.com/v/2971770

3.

RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(2)

키운 놈(들)…

오늘은 두번째 기간인 90년대에 대해 좀 이야기하겠다.

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Antisense라는 개념을 최초로 만든 사람은  저명한  Dr. Paul Zamecnik 교수(보통 그를 Antisense의 아버지라고 한다. 어머니??? 누군지 모른다)이지만, 제대로 키운 사람은 ISIS Pharmaceuticals의 설립자이자, 설립부터 지금까지의 CEO인  Dr. Stanley Crooke 이라고 해야 할 듯하다. 물론 중간에  Gilead  Sciences의 Dr. Mark Matteucci가 왕성하게 했지만, 1998년 GSK와 8년간 했던 antisense과제를 GSK가 종료하자… Gilead도 포기하고 모든 지적 재산권을 ISIS에 팔았으니… 결국  ISIS이다.

Stanley Crooke (M.D. and Ph.D)이라는 사람은 1989년 1월 ISIS 를 설립했는데, 그 전에는  SmithKline and French Laboratories라는 회사의 연구부문의 사장까지 했었다. 결국 1989년부터 현재까지 총 25년간 승진한번 못하고 계속 CEO로 있다. 지금 나이가 69살이니… 45살부터 계속 ISIS에 있다.

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넓은 의미의  NAT도 사실은 화학적으로 보면 phosphorothioate chemistry를 사용하고 있기 때문에 거의 대부분의 회사들이 ISIS로부터 chemistry를 사용하기 위한 licensing계약을 맺었거나, 초기에 ISIS가 Joint venture 식으로 참여한 기업들이다.

우선 ISIS의 phosphorothioate chemistry의 원리를 보자.

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위의 그림의 왼쪽은 DNA이다. 2번 탄소 위치에 -OH가 있으면 RNA(Ribonucleic acid)이고, H만 있으면 (보통 화학식에서는 H를 별도로 표시하지 않는 경우가 많다) DNA(deoxy-ribonucleic acid)이다.

두개의 뉴클레오타이를 연결하는 방식이 원래는 선행하는 뉴클레오타이드의 3번위치에 있는 -OH와 후행하는 뉴클레오타이드의 5번 위치의 triphophate간에 5′-3′ phosphodiester 결합을 하면서 backbone을 이룬다.

그런데 이런 phosphodiesterase linkage는 -특히 RNA는- 세포 내외부에 있는 다양한 핵산가수분해효소에 매우 약해서 금방 잘려서 없어진다.

그래서 인위적으로 phosphate에 있는 산소(O) 하나를 인(S, sulfur)로 바꾼게5′-3′ phosphorothioate linkage이다. 사실 이것은 Gilead에서 초기 연구를 이끌던  Dr. Mark Matteucci가 Genentech에 있을 떄 만들었던 것이다.

어쨌던 위와 같이 라이보즈 링에 별도의 변형이 없이 backbone에만 변형을 둔 것을 1세대라고 한다. 이러한 1세대에 기반한 제품이 ISIS가 1998년FDA허가를 받은, 최초의 NAT인 Vitravene (formiversen) 이다.  CMV(cytomegalovirus)에 의한 망막염 치료제로 주로 AIDS치료제들이 면역력이 떨어지면서 감염되는 바이러스에 대한 치료제로, 유리체내 주사(intraocular injection)을 한다.  CMV의 mRNA에 결합하는 21개짜리 올리고머이다.

 

1세대가 있으면 2세대도 있고, 3세대도 있겠지….. 그렇다… ISIS 연구자들 .. 이 ribose ring가지고 온갖 잘일은 다했다.

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 1세대가 ribose ring을 그대로 둔 것이라면 2세대는 2번 탄소 위치에 methyl-O-ethoxy [MOE]그룹을 붙인 것이다. 이렇게 변형을 하면 (이렇게 바꾸는게 간단해 보이지만, 이걸 합성하고, 올리고머로 만드는 사람들은 힘들다^^!!!)  sense RNA와의 결합력도 좋아지고, 훨씬 더 안정성을 가진다. 또한 결합력이 좋아지니 비특이적 결합은 오히려 줄어든다. 그래서 약효를 나타내는데 필요한 용량도 많이 (?) 줄어들어 100~400 mg/ week (한 사람당)이다. 이렇게 해서 나온 약물이 2013년 희귀질환 치료제로 허가를 받은  Kynamro (성분명: mipomersen, 분자량 7594.80 dalton)이다.  ApoB 100 mRNA를 표적으로 하는 20개짜리 올리고머이다.  이 약물은 현재 Genzyme에서 판매하고 있는데 작년에 Kynamro에 대해서 설명한 site가 있으니 한번 참고해 보길 바란다. 여기에

[참고로 Kynamro는 200 mg/week로 투여하는데 이걸 전에 썼던 “약사님…. 이 알약에 약분자가 몇개 들어 있나요? “ 방식으로 계산해 보면 세포 하나당 mipomersen 분자 약 42만개가 투여되는 셈이다. ]

 2.5세대가 ribose ring에 좀더 변형을 가해서…. 2번 탄소와 4번 탄소를 ethyl기를 넣어서 결합하게 해서 cyclic을 만든 것이다. 2.5세대는 2세대에 비해서도 결합력이 강해서 복용량이 5~40 mg/week 정도라고 하고, 경구용도 가능하다고 하는데…. cEt containing Gapmer라고 부른다…

[어떻게 보면 Santaris의 Locked nucleic acid와 유사해 보인다. 차이점이 있다면 2번과 4번 사이에 methyl이 아니고 ethyl이라는 것과 backbone이  phosphorothioate라는 점이다. (아래 그림은 Santaris의 LNA 구조이다)]

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어쨌든 ISIS는 phosphorothioate chemistry를 지속적으로 발전시켜서 현재까지 이르고 있다. 결국 이렇게 바꾼 antisense들은 1990년대말과 2000년ㄷ초반 발견하게 된 RNA interference 현상 (microRNA와 siRNA 포함)을 이용하기 위해 주사하는 oligomer에도 대부분 활용이 되게 된다.

대표적으로 Alnylam이 ISIS와 chemistry 관련하여 서로 많은 주고받는 계약을 했고, 두 회사는 microRNA에 특화된 Regulus를 공동 설립하기도 했다. 또한 Prosensa에도 phosphorothioate  chemistry 사용관련하여 licensing을 했다. 나중에는 Santaris와도 licensing  계약과 함께 특허 분쟁을 벌이기도 했다[사실 NAT 연구개발하면서 phosphorothioate 기술로부터 자유로운 회사는  Sarepta [morpholino 기술 사용] 뿐이라고 할 정도로 광범위한 chemistry관련 IP portfolio를 가지고 있다].

아래는 ISIS의 현재  파이프라인이다. 물론 이 중에 빨간 글씨로 된 것들은 파트너회사들이 개발하고 있는 것들이다.

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참고로 이 시기에 사실 다른 회사도 있기는 있다. AVI BioPharma라고 – 처음에는 AntiVirals Inc라고 함-하는 회사로 Dr. James Summerton이 세운 회사로 1990년대 중반에는  Morpholino라는 새로운  oligonucleotide를 만들어낸다.  여기에 대해서는 관심있는 분들은 여기를 참고하길….
그리고 이 기간에 2000년대에 펼쳐질 이야기의 서막이 열리는데 바로 1998년도  Andrew Fire와 Craig Mello가 C. elegans에서 RNA interference 현상을 발견해서 Nature에 논문을 낸 것이다. Antisense라는 개념에 더해서 RNA interference라는 개념이 생겨나는 순간이다. 하지만 앞에서도 언급했듯이 Antisense-mediated Rnase H dependent mRNA degradation이나 RNA interference 건 이를 위해 사용하는 올리고는 ISIS의 것을 기본으로 한다.
1998년도 Gilead가 먹고 살기 힘들어서  antisense분야를 떠났고 결국 phosphorothioate  chemistry의 창시자인 Dr. Mark Matteucci도 Gilead Science를 떠났다. 아마 계속 했다면 뭔가 좋은게 나왔을까?  하지만 확실한 건 그 때 antisense를 그만둔 것은 Gilead 현재  모습을 보면 잘한 일이라는 생각이 든다.
작년 초에 Fobes의 유명한 바이오 관련 기고자인  Mattehew Herper는 아래와 같은 제목의 글을 썼다.
“24년간의 고생 끝에 스탠리 크룩은 드디어 Antisene의 시대를 열었나?”
Stan Crooke은 Stanley 를 줄여 부른 말이고, 24년은 1989년부터 회사를 설립했으니 작년에는 24년인 셈이다
1월 29일 Kynamro의 FDA 허가에 즈음하여 쓴 글인데… 그리 밝지많은 않은 논조이다.
Matthew  는 2013년 연초에 ISIS를 “biotech’s worst winner”라고 칭했었다. 바이오텍 분야의 최악의 승자?
너무나 오랜 기간 고생한 Stan에게 좀 무례하다고 생각할 수도 있지만, 냉정하게 보면 그 동안의  antisense 분야를 키운 것은 맞지만, 아직도 아쉬움이 많은 분야이기에 맞는 표현일수도 있겠다.
여하튼… 그는…키운 놈이 맞기는 맞다.

RNA ? 내가 정말 모르고 살았구나.. NAT.. 뿌린놈..키운놈.. 먹는놈(1)

뿌린 놈(들)…

인생 살다보면… 씨 뿌리는 사람들 따로 있고, 키우는 사람, 추수하는 사람.. 그리고 먹는 사람들이 다른 것 같다. 억세게 운이 좋아 뿌리고, 키워 추수하고 먹기까지 다 하는 사람들이 간혹 있기는 하지만…

현재 핵산기반 치료제(NAT, Nucleic acid-based therapy) – 안티센트, siRNA, microRNA, 거기다가 요즘은 전통적인 gene therapy까지 포함시키기도 한다-라고 불리는 분야에서도 크게 다르지 않은 듯하다.

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앞으로의 이야기는 위의 그림을 따라 진행될 것이다.


 

이야기는 1970년대 후반으로 거슬러 올라간다.

1977년 10월에  미국PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences, 우리로 치면 학술원) 에 논문이 하나 발표된다.

Brandeis 대학교에 있는 Dr. Bruce Paterson이라는 사람이 제1저자로 되어 있고, 제목은 “Structural gene identification and mapping by DNA-mRNA bybrid-arrested cell-free translation” 으로 내용은 아래와 같다.

Cell-free translation system에다가 토끼의 베타 글로빈 단백질 만들도록 mRNA를 넣어준 후에 그 mRNA의 특정 서열과 상보적인 DNA 올리고머들을 넣어주었더니… “놀랍게도” 단백질 합성이 정지하더라는 것..

 

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지금보면 “너무 당연한게 이런 좋은 학술지에 나오나 싶을 정도의 싱식적인 이야기” 이지만, 당시만 해도 DNA조각이 mRNA에 결합해서 단백질 합성을 멈추게 하는 사실 자체가 놀랍고 신기할 따름이었다.

그리고 약 1년 후 그 유명한 Dr. Paul Zamecnik (당시 하바드의대에 있었음. 그해 은퇴, tRNA를 발견한 사람…. 93세로 사망할 떄까지 연구소를 운영한 사람…이분의 부고 기사를 참고) 가 아래와 같은 제목의 논문을 낸다.

“Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide”

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내용은 Bruce Paterson의 실험을 세포에서 한 것으로  “특정 DNA 올리고머를 처리했더니, 그 녀석이 세포로 들어가서 세포에서의 바이러스 증식을 억제하더라는 것이다. 이 DNA는 바이러스의 mRNA의 특정 부위에 상보적인 DNA이다.”는 것이다.

DNA 올리고머가 세포 안으로 들어가서 뭔가 단백질 합성을 억제한다는 놀라운 사실^^

하지만, 아쉽게도 1978년 이 연구논문은 Dr. Zamecnik 교수의 생각과는 달리 학계에 냉소적인 반응을 받으며 야심차게 주문했던 논문 리프린트는 그냥 책상위에 쌓여서… 노랗게 변할 떄까지 있었다고 한다.

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1979년에는 당시 오레곤주립대학에 있던 James Summerton이라는 분이 아래와 같은 제목의 논문을 Journal of Theoretical Biology 5월호에 낸다.

Intracellular inactivation of specific nucleotide sequences: A general approach to the treatment of viral diseases and virally-mediated cancers

내용은 바이러스의 유전자에 상보적으로 결합하도록 만들어진 단일가닥의 핵산 조각에 바이러스 유전자와 비가역적으로 화학결합을 하도록 하는 물질을 달아서 세포내로 넣어주면 핵산조각이 바이러스 유전자와 결합한 후 비가역적 화학결합을 통해 바이러스 유전자를 망가 뜨릴 수 잇다는 것… 새로운 “놀라운” 항바이러스제가 될 수 있다.

^^^ 지금으로보면 ADC(Antibody-drug conjugate)와 같은 개념으로 antibody 대신 DNA oligo를 쓰는 것이라고나 할까….

James-Summerton

이 사람 (Dr. James Summerton) 이 1980년도에 회사를 차린다… 이름하여 AntiVirals Inc.. 아마 이회사가 antisense라는 개념을 사업화하기 위해 차려진 최초의 바이오벤처일 것 같다.

[이 회사는 1990년대 초에 전통적인 핵산이 아닌 새로운 구조의 핵산을 만드는데 그게 흔히 알려진  morpholino… 이 회사는 1997년도에  IPO를 하고 회사이름은 AVI BioPharma라고 바꾼다… 그리고 2012년 다시 이름을 Sarepta Therapeutics로 바꾸게 된다. 창업자였던  James Summerton은 1997년 AVI를 나와서 새롭게 만든 morpholino를 만들어주는 용역 회사 겸 공급회사인 Gene Tools, LLC라는 spin-off를 설립한다. 이게 왜 Sarepta가 다른 nucleic-acid based therapy (NAT) 회사들과 달리 morpholino를 사용하는 이유이다]

그 사이 Dr. Zamecnik이 제안한 antisense 개념을 적용하려다보니 자연적인  DNA나 RNA  구조는 핵산가수분해효소들에 노출되어 몸 안에서 금방 잘리는 문제점이 있어서 backbone이 phosphate를 phosphorothioate로 바꾸게 된다.

Dr. Stanley Crooke이라는 전직  Smith Kline and French (나중에 Beecham과 합쳐져서 SmithKline Beecham plc가 된다)의 전직 연구개발 사장이 회사를 나와서 이 새로운 phosphorothioate chemistry 이용하여 1989년 1월에 미국 서부의 Carlsbad (샌디에고 약간 북쪽)에  회사를 설립하니 그 회사가 말도많고 탈도 많은 ISIS 이다. 새로운 회사는 1991년도에 IPO를 하고, phosphorothioate에 기반한 다양한 화학들을 발전시키면서 명실상부하게 antisense와 거의 동의어가 되는 회사로 커간다.  현재도 Stanley 는 회사의 CEO로 있다. 자신이 벌여놓은 일 추스니느라 꼬박 25년을 보내고 있다.

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1989년  ISIS가 설립되자 Dr. Paul Zamecnic도  Hybridon이라는 회사를 1990년도에 설립한다.

[이 회사는 나중에 Idera라는 회사에 인수되면서 현재까지 오고 있다]

이렇게 해서 현재 사용되고 있는 NAT 관련 기술인 phosporothioate와 morpholino chemistry 의 등장이 완료된다

여기서 잠간 화학식을 좀 보자.

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자연상태의 핵산은 Ribose 링을 (2번위치 탄소에 수소가 받어 있으면 DNA, OH가 붙어 있으면 RNA) 이용하는 구조이다. 그리고 핵산들간에 연결은 phosphate backbone을 유지하고 있다.

여기서 Phosphorothioate는 backbone의 구조를 바꾼 것이다.  위의 그림처럼, Phosphate에 붙어 있는 산소원자 하나를 인 (S, Sulphur)으로 바꾸는 것이다. 이렇게 되면 핵산가수분해효소에 의한 분해를 막을 수 있다.

여기에다 ISIS 는 ribose 링의 2번위체에 다양한 변화를 주어 1세대, 2세대, 3세대 등의 phosphorothioate 기술을 진화시킨다.

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물론, 여기에 하나 더한다면 Locked Nucleic Acid (LNA라고 간단히 부름) 기술이 저기 유럽 네덜란드에서 개발되고 있거 이 회사가 2003년도에 Santaris라는 회사로 전면에 등장하지만,  이건 좀 생략하고 보기로 하자.  [참고로 최근 Roche가 4.5억불에 Santaris를 인수했다는 소식이 지난주에 났다]

Morpholino 기술은 ribose오각고리를 사용하는 대신 morpholie 6각 구조를 사용하는 것이다. 그리고 Phosphate 구조에서 산소대신 amine을 사용한다. 굉장히 많은 변화이다. 이 morpholino기술은 결합력이 매우 강한 것으로 알려져 있다.

일단 여기까지가 Antisense의 초기 주인공들이 등장하게 되는 과정이다.

간추린다면 최초이 개념적 제시는 1977년도에 Bruce Paterson이 했지만 antisense의 아버지로 추앙받는 사람은 Dr. Paul Zamecnic이다. 그리고 Oregon의 James Summerton 그리고  industry추린 Stanley Crooke 이 등장함으로써 AVI(현재의 Sarepta), Hybridon 그리고  ISIS가 등장한다.

다음 편에서는 각각의 회사들이 어떻게 발전하고, 이러한 ASO chemistry들이 어떻게 siRNA 그리고 miRNA에 적용되는지를 이야기하겠다.